Skip to content

Białko X wirusa zapalenia wątroby B promuje inwazję komórek nowotworowych poprzez indukowanie ekspresji metaloproteinazy-1 w postaci błonowej i ekspresji cyklooksygenazy-2 ad 5

1 tydzień ago

728 words

Komórki CMO, CMX, HepG2, 2.2.15 lub 4pX (z tetracykliną lub bez niej) zostały dopuszczone do inwazji transfrakcji powleczonych Matrigelem w obecności 100.M NS398 lub DMSO jako kontroli, i 10.M PGE2 gdzie wskazane. Komórki, które migrowały do dolnej komory, oznaczono ilościowo, jak na rycinie 1. Potwierdziliśmy dalej nasze wyniki, stosując indukowaną HBx wątrobową linię komórkową, komórki 4pX, które eksprymują HBx, gdy tetracyklina jest usuwana z pożywki hodowlanej (21). Ekspresja HBx spowodowała regulację w górę MT1-MMP, co oznaczono metodą Western blot (Figura 4b, prawy panel). Tej indukcji ekspresji MT1-MMP zapobiegano przez dodanie inhibitora CO3-NS398. Ponadto usunięcie tetracykliny spowodowało zwiększenie zdolności inwazyjnej (rysunek 4d). Ponownie, hamowanie COX-2 zapobiegło wzmocnieniu komórek 4pX. zdolność inwazyjna. Następnie badaliśmy wpływ różnych NLPZ, które preferencyjnie hamują COX-2, COX-1 lub oba (odpowiednio meloksykam, indometacyna i ASA) na produkcję metaloproteinaz i inwazję komórek nowotworowych indukowaną przez HBx. Traktowanie komórek CMX meloksykamem powodowało zarówno obniżenie aktywacji MMP-2 i ekspresję MT1-MMP (Figura 5a) i silne hamowanie (50%) ich potencjału inwazyjnego (Figura 5b). ASA wykazywał umiarkowany efekt hamujący na komórki CMX, podczas gdy indometacyna nie wywierała żadnego działania. Żaden z NSAID nie wykazał znaczącego wpływu na inwazję komórek CMO i produkcję metaloproteinaz. Wyniki te razem wskazują na COX-2 jako kluczowy regulator indukcji ekspresji MMP i inwazji komórek przez HBx. Figura 5 Wpływ różnych NLPZ na aktywację MMP-2, ekspresję MT1-MMP i inwazję komórek nowotworowych indukowaną przez HBx. (a) Komórki CMO i CMX hodowano przez 24 godziny w obecności 60 .g / ml indometacyny, 60 .g / ml meloksykamu, 600 .g / ml ASA lub DMSO jako kontroli, a ilość aktywowanego MMP- 2 i MT1-MMP analizowano metodą Western blot. (b) Komórki CMX i CMO mogły atakować transwell powlekany Matrigelem w obecności 60 .g / ml indometacyny, 60 .g / ml meloksykamu, 600 .g / ml ASA lub DMSO. Komórki, które migrowały do dolnej komory, oznaczono ilościowo, jak na rycinie 1. HBx indukuje ekspresję COX-2. Blokada inwazji komórek i ekspresja MMP przez specyficzne inhibitory COX-2 (3 skłoniły nas do zbadania, czy HBx indukuje ekspresję COX-2. Analiza metodą Western blot COX-2 i COX-1 ujawniła, że komórki CMX, 2.2.15 i 4pX bez tetracykliny wyrażały wyższe poziomy COX-2 niż ich odpowiednie komórki kontrolne, podczas gdy COX-1 nie został wykryty (Figura 6a). Ilościowa analiza RT-PCR COX-2 potwierdziła indukcję enzymu w komórkach CMX i w komórkach wątroby Chang przejściowo transfekowanych wektorem ekspresyjnym HBx pSV-X (Figura 6b). Nie zaobserwowano różnic w poziomach transkryptów mPGES, cPGES lub COX-1 między komórkami CMX i CMO (dane nie przedstawione). Ponadto stwierdzono dwukrotny wzrost sekrecji PGE2 przez komórki zawierające HBx, które zostały zablokowane przez dodanie 10. M NS398 (nie pokazano). Te wyniki pokazują, że HBx jest zdolny do indukowania ekspresji COX-2 w niezależnych wątrobowych liniach komórkowych. Figura 6HBx indukuje ekspresję COX-2. (a) Ekspresję COX-2 i COX-1 oceniano metodą Western blot w komórkach CMO, CMX, HepG2, 2.2.15 i 4pX (leczonych lub nietraktowanych tetracykliną). (b) Obecność mRNA COX-2 analizowano za pomocą ilościowego RT-PCR w komórkach CMO i CMX, a w komórkach wątroby Chang przejściowo transfekowano pSV-X lub wektorem kontrolnym pSV-hygro. HBx aktywuje promotor COX-2 w sposób zależny od NF-AT. Aby zbadać transkrypcyjną regulację genu COX-2 przez HBx, transfekowaliśmy komórki Chang wątroby konstruktem reporterowym pochodzącym z lucyferazy, niosącym promotor COX-2 (pozycje od 1796 do +104), wraz ze wzrostem ilości ekspresji HBx wektor pSV-X. Jak pokazano na Figurze 7a, HBx był zdolny do aktywowania promotora COX-2 w sposób zależny od dawki. Podobnie, HBx indukował promotor COX-2 po transfekcji do komórek HepG2 (Figura 7a). Delecja regionu obejmującego pozycje od 1796 do około 170 promotora COX-2 lub mutacja punktowa proksymalnego miejsca NF-kB nie miała wpływu na aktywację promotora przez HBx. Przeciwnie, ukierunkowana mutageneza dystalnych i proksymalnych miejsc NF-AT powodowała odpowiednio 20% i 50% utratę indukowanej HBx aktywności promotora (Figura 7b). Ponadto podwójna mutacja obu miejsc NF-AT prawie całkowicie zniosła aktywację promotora przez HBx. Figura 7HBx indukuje promotor COX-2 w sposób zależny od NF-ATa. (a) Komórki Chang wątroby i HepG2 transfekowano 0,1 .g plazmidu reporterowego COX-2 opartego na lucyferazie P2-1900 (A1796 do +104) wraz ze wzrostem ilości (w wątrobie Chang) lub 5 .g (w HepG2). ) pSV-X
[patrz też: płatki drożdżowe przepisy, karma dla owczarka niemieckiego, guz jelita grubego rokowania ]
[więcej w: karma dla owczarka niemieckiego, kiedy szczepić na pneumokoki, olej lniany budwigowy oleofarm ]