Skip to content

Białko X wirusa zapalenia wątroby B promuje inwazję komórek nowotworowych poprzez indukowanie ekspresji metaloproteinazy-1 w postaci błonowej i ekspresji cyklooksygenazy-2 ad

1 tydzień ago

678 words

To inwazyjne zachowanie zależy od aktywności MT1-MMP i COX-2. Co więcej, HBx podwyższa ekspresję COX-2 zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Wyniki te demonstrują zdolność tego białka wirusowego do indukowania inwazji komórek nowotworowych i wspierają rolę HBx w późnych etapach rozwoju nowotworu i przerzutów. Metody Linie komórkowe, przeciwciała i odczynniki. Komórki CMX i CMO są pochodnymi komórek wątroby Chang (CCL13, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) i konstytutywnie wyrażają odpowiednio niskie poziomy HBx i genu oporności na higromycynę (16. 18). Wątrobowe pochodzenie komórek wątroby Chang zostało ostatnio ustalone za pomocą testów na mikromacierzach (19). Zastosowano trzy różne klony CMX, aby wykluczyć wyniki swoiste dla klonów. 2.2.15 komórki uzyskano z linii komórkowej ludzkiego wątrobiaka HepG2 przez stabilną transfekcję dwóch kopii od głowy do ogona genomu HBV (20). Ekspresja HBx w komórkach 2.2.15 i CMX została wcześniej zgłoszona (16, 20). Komórki 4pX są stabilnymi transfektantami pochodzącymi z unieśmiertelnionej mysiej linii komórek hepatocytów AML-12, w których ekspresję HBx można indukować przez usunięcie tetracykliny przez 24 godziny (21). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy braku FCS. Blokujące mAb anty-MT1-MMP LEM 2/15 i LEM 1/58 opisano wcześniej (22). Anty-MMP-2 i anty-MMP-9 zakupiono od R & D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Anty. – tubulinę, HGF, kwas acetylosalicylowy (ASA), indometacynę i doksycyklinę analogu tetracykliny otrzymano z Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) i anty-albuminę z DAKO A / S (Glostrup, Dania). . Anty-COX-2 i inhibitor COX-2 NS398 zakupiono od Alexis Corp. (San Diego, Kalifornia, USA), a anty-COX-1 pochodzi z Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Inhibitor MMP BB-3103 został dostarczony przez British Biotech (Oxford, Wielka Brytania). Meloxicam był miłym prezentem od Innogenetics GmbH (Heiden-Westfalen, Niemcy). Testy in vivo i in vitro inwazji. Testy in vivo inwazji z użyciem zarodków kurczęcych przeprowadzono jak opisano wcześniej (23). Pokrótce, 2 miliony komórek wysiano na górną część błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) 9-dniowego zarodka kurzego i umożliwiono inwazję przez 48 godzin. Genomowy DNA ekstrahowano z dolnej części CAM, a obecność ludzkich sekwencji Alu analizowano za pomocą ilościowej PCR. W przypadku testów in vitro inwazji komórek CMO, CMX, HepG2 i 2.2.15, mg zredukowanego czynnika wzrostu. Matrigel (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA) dodano do górnej komory Transwells z 12- pory i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Po przemyciu, 3 x 105 komórek wysiano na górną komorę. W przypadku komórek 4pX, 0,4 mg Matrigel wysuszono na powietrzu w 8,0 .m porów Transwells i zaszczepiono 4 x 104 komórek. Sześć godzin później, 10 ng / ml HGF dodano do dolnej komory i, jeśli to wskazano, inhibitor (5 uM BB-3103, 100 u n NS398, 60 ug / ml meloksykamu, 60 ug / ml indometacyny, lub 600 .g / ml ASA) lub 20 .g / ml mAb dodano do obu komór. Komórki pozostawiono do inwazji na Matrigel przez 48 godzin, po czym Transwells utrwalono w 4% formaldehydzie, żel usunięto bawełnianym wacikiem, a filtry pocięto i zabarwiono 4 , 6-diamidyno-2 -fenyloindolem. dichlorowodorek (DAPI). Komórki w ośmiu różnych polach zliczano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Każde doświadczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Western blot. Łącznie 3 x 105 komórek hodowano w nieobecności FCS i, gdy to wskazano, traktowano 10. LOO. M NS398, 60. G / ml meloksykamu, 60. G / ml indometacyny lub 600. G / ml ASA. Po 24 godzinach komórki poddano lizie w 60 ul buforu Laemmli, a zarówno lizaty jak i supernatanty analizowano metodą Western blot, jak opisano (18). RT-PCR. Komórki hodowano przez 24 godziny w 0% FCS, RNA ekstrahowano, a cDNA uzyskano z .g całkowitego RNA na drodze odwrotnej transkrypcji. Ilościową reakcję PCR MT1-MMP i COX-2 przeprowadzono w LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy) przy użyciu zestawu SYBR Green (Roche Diagnostics GmbH) i dwóch specyficznych zestawów primerów (5 (3-AGGGGCGGTGAGCGCTGCTG-3. I 5 . -TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3 (3 dla MT1-MMP; 5a-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3 (3 i 5 (3 -AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3 (3 dla COX-2). Plazmidy, transfekcje i testy lucyferazy. Plazmidy reporterowe niosące różne konstrukty ludzkiego promotora COX-2 połączonego z genem reporterowym lucyferazy zostały wcześniej opisane (24). pSV-X i wektor kontrolny pSV-hygro nosić odpowiednio gen X i fosfotransferazę higromycyny, pod kontrolą wczesnego wzmacniacza / promotora SV40 (25)
[przypisy: naturalne przyciemnianie włosów, przychodnia pruszcz gdański, karma dla owczarka niemieckiego ]
[hasła pokrewne: pytania do zlotych mysli, ile kalorii spalamy podczas biegania, płatki drożdżowe przepisy ]