Skip to content

Białko X wirusa zapalenia wątroby B promuje inwazję komórek nowotworowych poprzez indukowanie ekspresji metaloproteinazy-1 w postaci błonowej i ekspresji cyklooksygenazy-2 cd

3 miesiące ago

758 words

Wektor ekspresyjny pSH102C418 (miły prezent od Gerald Crabtree, Stanford University, Stanford, California, USA) wywodzi się z pBJ5 i koduje czynnik jądrowy aktywowanego mutanta delecyjnego komórek T (NF-AT2) (1. 418), który funkcjonuje jako dominujący negatywny wynik dla wszystkich izoform NF-AT (25). Transfekcje przeprowadzono jak podano wcześniej (25), stosując 0,1 .g plazmidu reporterowego, 4 .g pSV-X lub pSV-hygro i, jeśli to wskazane, .g pSH102C418 lub pBJ5, stosując liposomalny DOSPER. odczynnik (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). Po 6 godzinach pożywkę usunięto i komórki hodowano w DMEM z 2% FCS przez 18 godzin. Komórki poddano lizie i mierzono aktywność lucyferazy. Wyniki HBx indukuje inwazję komórek nowotworowych. Aby określić, czy HBx może zaindukować inwazję komórek nowotworowych, zastosowaliśmy podejście zarówno in vivo, jak i in vitro. Inwazję komórek in vivo oceniano przy użyciu modelu inwazji zarodków kurzych, w którym komórki badano pod kątem ich zdolności do degradacji zarodka CAM i przenikania do krwioobiegu (23). Komórki CMX wykazały pojemność inwazyjną czterokrotnie wyższą niż w kontrolnych komórkach CMO (rysunek 1a). Ponadto, komórki 2.2.15 wykazały 7,9 razy więcej potencjału inwazyjnego niż ich macierzyste komórki HepG2 (Figura 1b). Figura 1HBx indukuje inwazję komórek nowotworowych in vivo i in vitro. (a i b) In vivo. CMO i CMX (a) lub HepG2 i 2.2.15 (b) analizowano pod kątem ich zdolności do zaatakowania CAM zarodka kurzego. Wyniki wyrażono jako procent ludzkiego DNA (po lewej) lub jako liczbę komórek wewnątrznaczyniowych (po prawej). Eksperymenty przeprowadzono co najmniej czterokrotnie. (c i d) Inwazja in vitro. Zdolność inwazyjną komórek CMO i CMX (c) lub HepG2 i 2.2.15 (d) badano przy użyciu Transwells powlekanych Matrigelem. Komórki w spodniej części filtra zostały zabarwione i zliczono osiem niezależnych pól. Wyniki są wyrażone jako średnia wartość. SE trzech niezależnych punktów. Inwazję komórek in vitro określono przy użyciu testu inwazji Matrigel. Komórki CMX wykazały 2,3-krotnie wyższą skuteczność inwazyjną niż komórki CMO (Figura 1c) i podobnie, komórki 2.2.15 wykazały zwiększoną zdolność inwazyjną w odniesieniu do komórek HepG2 (Figura 1d), co wskazuje, że HBx był zdolny do wywoływania inwazji komórek zarówno in vivo i in vitro. Inwazja indukowana HBx koreluje ze zwiększoną ekspresją aktywowanego MMP-2. Aby zbadać możliwą rolę MMP w inwazji komórek wywołanej HBx, najpierw analizowaliśmy wpływ ogólnego inhibitora MMP BB-3103 na inwazyjną pojemność komórek CMX i CMO. Testy inwazji transweli przeprowadzone w obecności BB-3103 wykazały zmniejszoną liczbę komórek CMX i CMO w dolnej komorze Transwell (Figura 2a), co sugeruje udział MMP w inwazji żelu przez te komórki. Figura 2. Inwazja komórek nowotworowych indukowana 2HBx jest zależna od aktywności metaloproteinazy, a HBx podnosi ekspresję aktywowanej MMP-2. (a) Komórki CMO i CMX zostały dopuszczone do inwazji transwell opłaszczonego Matrigelem w obecności inhibitora MMP BB-3103 lub DMSO jako kontrola. Inwazję oznaczono ilościowo, jak na Fig. 1. (b) Komórki hodowano przez 24 godziny w pożywce bez surowicy i analizowano żelatynę zymograficzną supernatantów hodowli komórkowej stymulowanych PMA ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (kontrola) i różnych komórek wątrobowych. linie zostały wykonane. (cid) CMO i CMX (c) lub HepG2 i 2.2.15 (d) lizaty komórkowe i supernatanty analizowano pod kątem ekspresji MMP-2 i MMP-9 metodą Western blot. MAb anty-.-tubuliny i anty-albuminą zapewniają równe obciążenie białkiem we wszystkich ścieżkach. W celu dalszego wsparcia związku między ekspresją MMP a inwazją komórek, przetestowaliśmy aktywność różnych MMP za pomocą testów zymograficznych. Jak pokazano na Figurze 2b, tylko pasmo 66 kDa, prawdopodobnie odpowiadające MMP-2, wykryto przez zymografię żelatynową w supernatantach hodowli komórek pochodzących z wątroby Wat i HepG2. Nie wykryto aktywności MMP, gdy jako substrat użyto kazeiny (dane nie pokazane), co sugeruje, że nie były wydzielane żadne inne MMP. Następnie analizowaliśmy obecność żelatynazyn MMP-2 i MMP-9 metodą Western blot zarówno w supernatantach hodowli komórkowej, jak iw ekstraktach komórkowych. Zwiększoną ilość aktywowanej izoformy 62-kDa MMP-2 znaleziono w ekstraktach komórek CMX w porównaniu z komórkami CMO (Figura 2c), podczas gdy izoformę 66Ma-pro-MPa-66 nie wykryto w ekstraktach komórkowych (Figura 2c), chyba że blot był prześwietlony (dane nie pokazane). Przeciwnie, forma 66 kDa była jedyną izoformą MMP-2 występującą w supernatantach hodowli komórkowej, chociaż nie obserwowano istotnych różnic w ekspresji tego białka między komórkami CMX i CMO. Aktywowana MMP-2 była również zwiększona w ekstraktach komórkowych 2.2.15 w porównaniu z ekstraktami HepG2 (rysunek 2d)
[patrz też: karma dla owczarka niemieckiego, mleko kokosowe właściwości, ile kalorii spalamy podczas biegania ]
[podobne: medicor gliwice, nk w komórce, specjalistyka czechów ]