Skip to content

Delecja fosfodiesterazy 4D u myszy skraca znieczulenie a-adrenoceptorowe, behawioralny korelator wymiotów ad

2 tygodnie ago

416 words

W niniejszym badaniu zastosowano kombinację podejść farmakologicznych i genetycznych w celu wyjaśnienia roli podtypów PDE4 w odwracaniu anatezji zależnej od P2-adrenoceptora, behawioralnego korelatu wywołanego przez wywoływane przez inhibitor PDE4 inhibitora. U osobników, które nie wymiotują. Względną rolę podtypów PDE4 badano za pomocą tego modelu i myszy z niedoborem PDE4B i PDE4D. Metody Czas trwania znieczulenia. Eksperymenty przeprowadzono na myszach C57BL / 6 (samiec, 15. 28 g) uzyskanych z Taconic (Germantown, New York, USA), na myszach 129SvJ (samiec, 23. 28 g) z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). ) lub na myszach z niedoborem PDE4B- i PDE4D i ich miotami (samiec, 14. 48 g) wytworzonymi na Uniwersytecie Stanforda na mieszanym tle C57BL / 6 × 129 / Ola (20, 21). Trzymano je w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności, w grupach po cztery lub pięć, z pożywieniem i wodą dostępnymi ad libitum. Dopuszcza się okres 5 do 6 dni aklimatyzacji przed eksperymentowaniem. Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami w Centrum Badań Terapeutycznych Merck Frosst, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Pielęgnacji Zwierząt. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami (17, 19). Pokrótce, myszy znieczulono kombinacją ksylazyny (10 mg / kg) i ketaminy (80 mg / kg) lub pentobarbitalu sodu (50 mg / kg) podawanego w pojedynczej iniekcji dootrzewnowej. Piętnaście minut później zwierzętom wstrzyknięto podskórnie różne stężenia badanego związku (0,001 . 30 mg / kg) lub nośnik, a następnie umieszczono w grzbietowej pozycji leżącej. Wszystkie badane związki świeżo rozpuszczono w 60% (obj./obj.) Glikolu polietylenowego (PEG, masa cząsteczkowa 200) w soli fizjologicznej każdego dnia i podawano w dawce wynoszącej 10 .l / g wagi ciała. Powrót odruchu prostującego (tj. Gdy zwierzę nie pozostawało już na plecach i samoistnie ustawił się w pozycji leżącej) został wykorzystany jako punkt końcowy do pomiaru czasu trwania znieczulenia. W znieczuleniu wywołanym pentobarbitalem sodu eksperymenty zakończono po 120 minutach po wstrzyknięciu związku testowego. W przypadku zwierząt, które nie odtworzyły odruchu prostującego do tego czasu, odnotowaliśmy maksymalny dozwolony czas. Plazma i tkanka mózgowa. Pod koniec eksperymentu pobrano próbki osocza i tkanki mózgowej do oznaczenia ilościowego badanych związków. Jedną godzinę po podaniu pobierano próbki od grupy leczonej najwyższą dawką badanego związku. Zwierzęta uśmiercono w komorze CO2. Krew pobrano przez nakłucie serca w heparynizowanych mikrotubkach (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA) i wirowano przez 5 minut (5.585 g, mikrowirówka naukowa VWR, model V, VWR Canlab, Mississauga, Ontario, Kanada) i osocze przechowywano w temperaturze <80 ° C. Zwierzęta poddano perfuzji 15 ml roztworu soli fizjologicznej przez lewą komorę, a mózgi usunięto i przechowywano w temperaturze <80 ° C do czasu analizy. Próbki analizowano za pomocą HPLC (Alliance Waters 960, Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA) lub za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią masową (API 100 i API 2000, MDS Sciex, Concord, Ontario, Kanada). Testy PDE4. Cztery reprezentatywne ludzkie enzymy, PDE4A248 (HSPDE4A4B4484886) i jego ekwiwalenty PDE4B, PDE4C i PDE4D, z rozbieżnymi N-końcami wariantów splicingowych obciętymi do konserwatywnego dipeptydu Gln-Thr powyżej domeny katalitycznej dla każdego podtypu PDE4, zostały wyrażone jako białka fuzyjne GST i oczyszczone do homogenności z komórek Sf9 zgodnie z opublikowaną procedurą (11). Wartości IC50 (średnia . SD, n . 3) inhibitorów określono z 11-punktowej krzywej dawka-odpowiedź przeprowadzonej w dwóch powtórzeniach przy 0,1 .M 3H-cAMP w 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl2, mM EDTA. i 100 mM KCl w 30 ° C (12). Łodygi mózgu wycięto z myszy pozbawionych PDE4B- i PDE4D i ich rodzeństwa z miotu typu dzikiego i homogenizowano w hipotonicznym buforze zawierającym inhibitory proteazy (22). Próbki homogenatów testowano pod względem aktywności PDE, stosując jako substrat 1. M cAMP. Aktywność PDE oceniano pod nieobecność (całkowita aktywność) lub obecność 10 .M rolipramu (działanie niewrażliwe na rolipram). Aktywność wrażliwą na rolipram (aktywność PDE4) uzyskano przez odjęcie aktywności niewrażliwej na rolipram od całkowitej aktywności PDE. Wartości skorygowano o ilość białka ekstraktu dodanego do testu. Analiza Western blot. Łodygi mózgu wycięto z dorosłych myszy pozbawionych PDE4B i PDE4D i ich rodzeństwa z miotu typu dzikiego i natychmiast homogenizowano (30 uderzeń w homogenizatorze Dounce) w buforze zawierającym 50 mM Tris-Cl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 5% glicerol, 10 mM NaF, mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 10 mM pirofosforanu sodu, mM ortowanadanu sodu, mieszanina inhibitorów proteazy (Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana, USA), mM Pefabloc SC (Roche Diagnostics), % NP-40 i 10 mM P-merkaptoetanolu [patrz też: gorące szesnastki, pytania do zlotych mysli, naturalne przyciemnianie włosów ] [podobne: mediq legionowo cennik, pytania do złotych myśli, luxmed mehoffera ]