Skip to content

IFN- działanie w mediach wielkich elastycznych tętnic, nowatorskie miejsce uprzywilejowane ad

4 tygodnie ago

753 words

Serce, aortę i narządy wewnętrzne usunięto en bloc, przepłukano w PBS i barwiono na aktywność (3-galaktozydazy (a-gal) w 37 ° C przez noc (11), przed utrwaleniem w 4% paraformaldehydzie. Barwienie oceniono pod mikroskopem preparatywnym, a zdjęcia wykonano aparatem cyfrowym Kodak DC120. Antygen wirusowy wykrywano za pomocą immunohistochemii, jak opisano (1). W celu detekcji komórek zapalnych zamrożone skrawki utrwalono w mieszaninie 1: metanol / aceton w ~ 20 ° C. Aktywność endogennej peroksydazy była zahamowana (1), zablokowano szkiełka (1% BSA, 0,2% odtłuszczone mleko w proszku, 0,3% tryton w PBS) przez 30 minut, a następnie zablokowano biotynę (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA). Stosowano mAb szczurzego: anty-CD4 Ab GK1,5 (12); anty-CD8 Ab H35 (12), anty-B-220 Ab 14,8 (12) i anty-CD11b Ab 5C6 (CRL-1969; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) i dodano przy 25 ng / ml przez noc w 4 ° C. W supernatantzie mAb F4 / 80 (13) zastosowano rozcieńczenie 1: 2000. Szczur IgG zastosowano jako kontrolę ujemną. Barwienie wykrywano za pomocą F (ab.) 2 sprzężonego z biotyną osła drugorzędowego anty-szczurzego Ab (1,2 .g / ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Odtworzenie szpiku kostnego i IFN-y zubożenie in vivo. Czterotygodniowe myszy zostały otrzymane w letarstwie z czynnikiem 1100R, a następnie dożylne wstrzyknięcie do 2 x 107 zarodkowanych komórek szpiku kostnego z dopasowanego pod względem płci 129Ev / Sv lub IFN-yR3 /. myszy. Procent rekonstytucji oceniano po 6. 8 tygodni za pomocą ilościowych Southern błot z DNA limfocytów krwi obwodowej (zestaw do pobierania krwi QIAamp, QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, USA) pociętego BamH1 i sondowano fragmentem 2 kb odpowiadającym eksonowi 4 genu IFN-yR (14). Aby przejściowo zubożać IFN-y, myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 250 .g neutralizującego IFN-a mAb chomika H22 (15) w 0,5 ml jałowej soli fizjologicznej dzień przed i 6 dni po zakażeniu. W celu długotrwałego zubożenia IFN-y myszy wstrzyknięto co tydzień aż do uśmiercenia (6 tygodni). Dawkę Ab wybrano w oparciu o wcześniejsze doniesienia o skutecznym IFN-y. wyczerpanie za pomocą H22 (15, 16). Pierwotne kultury komórkowe. Pierwotne mysie komórki aorty zostały przygotowane w oparciu o opublikowane protokoły (17, 18). Zebrano 10 aort piersiowych od 4- do 6-tygodniowych samców myszy 129Ev / Sv, umieszczono w HBSS z 0,2 mM CaCl (HBSS / Ca), a przydanki usunięto przez tępe cięcie. Trawienie kolagenazą, a następnie trypsyną dało kulturę komórkową / przydaną. Dalsze trawienie kolagenazą, elastazą i trypsyną dało kulturę przyśrodkową. Po 3. 4 dniach komórki traktowano 0,12% trypsyną plus 0,5 mM EDTA przez 5 minut w 37 ° C i poddawano replikacji. Co 2. 4 dni później każdą studzienkę pasażowano w dwóch nowych odwiertach. Komórki (5 do 50 x 104) otrzymano z każdej hodowli po drugim pasażu i wysiano (1 do 3 x 104 komórek) do ośmiokomorowych szkiełkowych prowadnic szklanych (LabTek; Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA) do zastosowania w badania immunofluorescencyjne, 24-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej (TC) do mikroskopii z kontrastem fazowym lub 12-dołkowe płytki TC do mikroskopii elektronowej (EM). Dwa do trzech dni później kultury traktowano przez 48 godzin z lub bez IFN-y. (250 j./ml dla kultur przyśrodkowych i 64 j./ml dla kultur przyzębia / przydanki, Genzyme Pharmaceuticals, Cambridge, Massachusetts, USA), zakażono w moi 5 przez 2 godziny w 37 ° C, a następnie hodowano na świeżej pożywce z lub bez IFN-y. Świeże media z lub bez IFN-y był dodawany co 3 dni. Obrazy z kontrastem fazowym wykonano na mikroskopie Olympus CK2 wyposażonym w aparat cyfrowy Kodak DC120 i program do akwizycji Kodak MDS 120 v1.0. Immunofluorescence i EM. W celu immunofluorescencji komórki utrwalano przez 20 minut w ~ 20 ° C w metanolu, płukano, a następnie blokowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w stężeniu 20 ug / ml BSA, 20% surowicy koziej, 0,01% trytonie w PBS. Przeciwciało poliklonalne anty-AHV68 (1) lub surowicę przed immunizacją zastosowano w rozcieńczeniu 1: 500 w celu wykrycia antygenu wirusowego. Mysie mAb dla ludzkiej aktyny mięśniowej (HHF35; DAKO Corp., Carpinteria, California, USA) użyto w stężeniu 0,55 .g / ml do wykrycia SMC. Jako kontrolę ujemną zastosowano abocjację z izotypem Ab do hemocyjaniny skałoczepa (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Pierwotne Ab były inkubowane przez noc w 4 ° C, a drugorzędowe Ab były dodawane przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aktinę mięśniową wykrywano za pomocą sprzężonego z Cy3 kozim anty-mysim drugorzędowym przeciwciałem (10 .g / ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), a antygen wirusowy wykrywano stosując sprzężone przeciwciało drugorzędowe z zielonego Oregon 488a koziego przeciw króliczym drugorzędowym przeciwciałem (7. g / ml; Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Dodano Bisbenzimid (0,5 .g / ml) w celu zabarwienia błękitu jąder
[patrz też: ciastka z wróżbą teksty, wkładki higieniczne dla mężczyzn, olej lniany budwigowy oleofarm ]
[przypisy: maxi3vena opinie, boję się jeździć samochodem, pekajace piety ]