Skip to content

Kwasowa proteoliza przez neutrofile: implikacje dla rozedmy płucnej w niedoborze a1-antytrypsyny ad

3 miesiące ago

756 words

Roztwór buforowany HBSS i M HEPES zakupiono z GIBCO BRL (Grand Island, New York, USA). Serum. Surowicę pobierano od osobników o różnych fenotypach AAT (Pi M, Pi MS, Pi MZ, Pi SZ i Pi Z), jak określono przez ogniskowanie izoelektryczne (12). Poziomy AAT zostały określone za pomocą automatycznego testu immunologicznego fluorescencji (13). Izolacja PMN. Ludzkie PMN wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników, stosując wirowanie Ficoll-Hypaque, a następnie sedymentację dekstranową (14). PMN zawieszano ponownie w 4 x 106 / ml w HBSS (pH 7,4) w 4 ° C i stosowano bezzwłocznie w eksperymentach wyszczególnionych poniżej. Przygotowanie powierzchni podłoża. Ludzka fibronektyna w osoczu była skoniugowana z TRITC (11). Poszczególne studzienki na szkiełkach laboratoryjnych LabTek (Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA) powlekano przez noc w temperaturze 4 ° C, w ciemności, za pomocą 20 .g fibronektyny-TRITC. Powierzchnie fibronektyny-TRITC przemyto 3 razy HBSS, opsonizowano króliczą IgG przeciw fibronektynie przez godzinę w 37 ° C i przemyto 3 dodatkowe razy w celu usunięcia nieadsorbowanych białek. Ilościowe obrazowanie kwantowych zdarzeń proteolitycznych. HEPES (25 mM, pH 7,1) dodano do surowicy od dawców o różnych fenotypach AAT w celu buforowania próbek surowicy w otaczającym powietrzu. Podwielokrotności (150. L) próbek surowicy dodano następnie do studzienek powleczonych szkiełkowych szkiełek komorowych, a następnie dodano świeżo wyizolowane PMN (20 000 komórek w 5. L). Ta procedura spowodowała jedynie minimalne rozcieńczenie surowicy w końcowej zawiesinie, która stanowiła 94,4% surowicy. Szkiełka komorowe inkubowano w ciemności przez 30 minut w 37 ° C, studzienki przemyto dwukrotnie HBSS, a następnie komórki utrwalono przez 5 minut PBS zawierającym 3% (wag./obj.) Paraformaldehydu i 1% (objętość / objętość). vol) aldehyd glutarowy (pH 7,4). Studzienki przemyto dwa razy w HBSS, komory usunięto, a szkiełko zamontowano w PBS zawierającym 25% (obj./obj.) Glicerolu i 250 .g / ml p-fenylenodiaminy w celu zmniejszenia fotowybielania. Szkiełka badano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z kontrastem fazowym i padającym światłem (Leitz Dialux 20 z zestawem filtrów L2 i Leitz NPL Fluotar × 50, obiektyw NA 1.00, Leica GmbH, Wetzlar, Niemcy). Obrazy kwantowych zdarzeń proteolitycznych wychwycono za pomocą chłodzonego aparatu CBC Photometrics CH250. Oprogramowanie MetaMorph (Universal Imaging, West Chester, Pennsylvania, USA) zostało użyte do przetwarzania obrazów cyfrowych i pomiaru wielkości kwantowych zdarzeń proteolitycznych. Modelowanie kwantowych zdarzeń proteolitycznych. Matematyczne modelowanie dyfuzji HLE po degranulacji PMN przeprowadzono przy użyciu Mathcad dla Windows (Mathsoft, Cambridge, Massachusetts, USA). Zastosowaliśmy rozwiązanie do równania Ficka dyfuzji dla geometrii cylindrycznej ze skończonego źródła o znanym stężeniu (2, 15). To rozwiązanie określa stężenie HLE (C) w funkcji promienia (r) i czasu (t). Zajęliśmy C0, początkowe stężenie elastazy w granulach azulhilu, do 5,33 mM (2); D, współczynnik dyfuzji dla HLE, wynosić 0,954 x 10. 6 cm2 s. (2, 16, 17); a a, średni geometryczny promień granulki azuropulowej, wynosił 0,177 .m (2, 18). Obliczyliśmy stężenie HLE w odstępach 0,01-.m od 0 do 15 .m od centrum degranulacji, w odstępach 1-milisekundowych od do 130 milisekund po degranulacji. Z powstałej macierzy rozwiązań numerycznych skonstruowaliśmy dwuwymiarowe mapy konturowe przewidywanego stężenia HLE w różnych momentach w przestrzeni otaczającej zdarzenie degranulacji, za pomocą SigmaPlot (SPSS Science, Chicago, Illinois, USA). Statystyka. Wyniki dla niesparowanych danych porównywano za pomocą 1-drożnej ANOVA Kruskala-Wallisa na rangach i wielokrotnych porównań parami Dunn za pomocą pakietu oprogramowania SigmaStat; Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Wyniki Immunoreaktywne poziomy AAT w surowicy od dawców o różnych fenotypach AAT. Immunoreaktywny AAT oznaczono ilościowo w surowicy od osób z fenotypami PiM, Pi MS, Pi MZ, Pi SZ i Pi Z AAT (Tabela 1). Wartości dla każdego fenotypu były podobne do tych podanych w innych seriach (5), a żadna z wartości w naszym badaniu nie była spodziewana dla żadnego z fenotypów. Tabela Immunoreaktywny AAT w surowicy od dawców mających różne fenotypy AAT Kwasowe zdarzenia proteolityczne w surowicy od dawców o różnych fenotypach AAT. Użyliśmy eksperymentalnego modelu PMN, migrującego na opsonizowanej fluoresceinowanej fibronektynie (11), podczas gdy kąpali się w surowicy, aby obserwować i mierzyć kwantowe zdarzenia proteolityczne w obecności surowicy od dawców o różnych fenotypach AAT. Wykazaliśmy, że HLE jest dominującą proteinazą, która pośredniczy w zewnątrzkomórkowej aktywności proteolitycznej w tym modelu (11). Komórki skąpane w surowicy Pi MZ i Pi SZ (ryc. 1, b i c) były związane z dyskretnymi, zaokrąglonymi zdarzeniami proteolitycznymi, które miały podobną wielkość i wygląd do tych obserwowanych w obecności surowicy Pi M (ryc. 1a)
[więcej w: najlepsza pozycja do spania, epiduo żel cena, gorące szesnastki ]
[więcej w: gorące szesnastki, ksylazyna, epiduo żel cena ]