Skip to content

Potencjalne mechanizmy ekspansji ludzkich komórek NK w warunkach in vivo podczas leczenia niską dawką IL-2 ad

1 tydzień ago

713 words

Rekombinowaną ludzką (rh) IL-2 stosowaną do testów proliferacji in vitro uzyskano z Hoffman La-Roche (Nutley, New Jersey, USA, aktywność właściwa 1,53 x 107 IU / mg). rhIL-12 był miłym darem Instytutu Genetyki (Cambridge, Massachusetts, USA, aktywność właściwa 4,5 × 106 U / mg). Ligand rh-kit (KL) był darem Immunex Corp. (Seattle, Washington, USA). Izolacja ludzkich komórek NK. Ludzkie komórki NK CD56bright wyizolowano do czystości większej niż 97% ze świeżych leukopaków (American Red Cross, Buffalo, New York, USA) z zastosowaniem immunomagnetycznego zubożania kulek i sortowania komórek, jak opisano wcześniej (12). W celu izolacji komórek T, nie przywiązane PBMC wybarwiono anty-CD5-PE i posortowano za pomocą cytometru przepływowego FACStar Plus (Becton-Dickinson). Posortowane populacje określono na 97% czystości za pomocą cytometrii przepływowej. Test proliferacji, żywotności i oznaczania liczby. Posortowane komórki NK CD56bright wysiano na 96-studzienkowych płytkach w stężeniu 2,0 x 104 na 200. L pożywki zawierającej RPMI-1640, 10% ludzkiej surowicy AB (C-six Diagnostics, Mequon, Wisconsin, USA), antybiotyki i rhIL-2 przy końcowym stężeniu 100 pM (23 IU / ml). Komórki inkubowano w 37 ° C, a zmiany pożywki przeprowadzono co 72 godziny przez usunięcie 100. L i zastąpienie 100. L identycznego podłoża zawierającego 100. M rIL-2. Dwadzieścia cztery godziny przed zbiorem do każdej studzienki dodano .l [3H] tymidyny (3H-TdR, Amersham, Bucks, Wielka Brytania) i inkubowano dalej w 37 ° C. Próbki zebrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym Beckman LS 1801 (Fullerton, Kalifornia, USA). Standardowe testy wykluczania i liczenia żywych barwników przeprowadzono przy użyciu błękitu trypanowego i hemocytometru w potrójnych dołkach przez osobnika zaślepionego warunkami doświadczalnymi. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnią liczbę minut na minutę (cpm). SEM. Ilościowe oznaczanie IFN-y produkcja. Komórki NK CD56bright wyizolowano i hodowano w kombinacji IL-2 i IL-12, jak opisano w innym miejscu (13). Komórki hodowano przez 2, 6 lub 12 dni w obecności 100 pM IL-2. W tym czasie dodano IL-12 (10 U / ml) i nM IL-2, i 48 godzin po tym dodaniu (tj. Dniach 4, 8 i 14), 200. L supernatantu hodowli zebrano z duplikatu studzienki i zamrożono w temperaturze ~ 70 ° C aż do oznaczenia na obecność IFN-y. białko. Ocena ilościowa ludzkiego IFN-y w tych supernatantach zastosowano komercyjne zestawy ELISA (czułość 2,0 pg / ml, Biosource International), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Testy cytotoksyczności. Posortowane komórki NK CD56bright hodowano przez wskazane okresy w 96-studzienkowych płytkach przy 2 x 104 komórek na studzienkę, z lub bez 100 pM rIL-2. We wskazanych czasach mierzono cytotoksyczność wobec docelowych komórek K562 w standardowym 4-godzinnym teście uwalniania 51Cr, jak opisano uprzednio (13), przy stosunku efektora do celu wynoszącym 5: 1. Testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako procentową lizę specyficzną. SEM. Analiza cyklu komórkowego. Podzbiory limfocytów krwi obwodowej (PBL) analizowano pod względem wskaźnika mitotycznego za pomocą barwnika Hoechst H33342 (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, Kalifornia, USA), mAb PBS na powierzchni komórek specyficznych względem podzbioru limfocytów i cytometrii przepływowej. Barwnik Hoechst to interkalator DNA, który pozwala na oznaczenie frakcji komórek w obu fazach G0 / G1 i S / G2 / M cyklu komórkowego przez ilość obecnego DNA (14). Komórki odwirowano i ponownie zawieszono w 2 mg Hoechst H33342 / ml PBS (pH 7,1) w stężeniu x 106 komórek / ml, umieszczono w 37 ° C na wstrząsanej łaźni wodnej na godzinę, odwirowano i ponownie zawieszono w świeżym zimnym 2 mg. / mL Hoechst H33342 / PBS (pH 7,1) w stężeniu 2 x 106 komórek / ml. Populacje komórek znakowano następnie mAb anty-CD3-FITC lub anty-CD56-PE, przemyto dwukrotnie i ponownie zawieszono. Oznaczenie cyklu komórkowego na odrębnych podzbiorach limfocytów przeprowadzono na FACStar Plus przez bramkowanie komórek barwionych FITC lub PE podczas analizy pod kątem fluorescencji barwnika Hoechst. Testy fragmentacji DNA i analiza cyklu komórkowego. Ocenę rozszczepienia endonukleolitycznego DNA charakterystycznego dla apoptozy przeprowadzono za pomocą barwienia jądrowego jodkiem propidyny (PI) (15) i elektroforezą w żelu agarozowym (16), jak opisano wcześniej. Aby wykryć jednocześnie fazę cyklu komórkowego i rozszczepienie DNA w odniesieniu do apoptozy, testowaliśmy inkorporację BrdU w połączeniu z barwieniem PI, stosując modyfikację metody opisanej przez Renno i in. (17). Pokrótce, komórki inkubowano w obecności 0,05 mM BrdU przez 4 godziny, zbierano i utrwalano w 70% etanolu przez 30 minut.
[patrz też: ile kalorii spalamy podczas biegania, sanatorium goczałkowice zdrój, guz jelita grubego rokowania ]
[przypisy: kiedy szczepić na pneumokoki, olej lniany budwigowy oleofarm, najlepsza pozycja do spania ]