Skip to content

Potencjalne mechanizmy ekspansji ludzkich komórek NK w warunkach in vivo podczas leczenia niską dawką IL-2 cd

2 miesiące ago

765 words

DNA następnie częściowo denaturowano przez traktowanie 3 N HCl przez 20 minut, a następnie zobojętnianie 0,1 M Na2B4O7. Komórki następnie wybarwiono mAb anty-BrdU sprzężonym z FITC (Becton-Dickinson), ponownie zawieszono w roztworze PI przez 5 minut w 37 ° C i analizowano za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej. Długotrwała hodowla komórek HP34 + HPC. Aspiraty szpiku kostnego uzyskano od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody. CD34 + CD2. CD16. HPC wyizolowano do czystości 97% stosując perełki immunomagnetyczne, a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie, jak opisano w innym miejscu (18). Komórki następnie wysiewano w stężeniu 2 x 104 w 200 ul RPMI-1640 z 10% ludzką surowicą AB, antybiotykami i 100 pM rIL-2, z lub bez 7 nM ligandu c-kit (KL). Sto mikrolitrów pożywki hodowlanej zastąpiono identycznymi stężeniami czynników w dniach 7, 14, 17 i 20. Płytki zebrano w dniu 21 dla analizy numerycznej, morfologicznej, cytometrii przepływowej i analizy cytotoksycznej, jak opisano wcześniej (18). Wyniki Odpowiedź proliferacyjna komórek NK CD56bright na długotrwałą hodowlę z rIL-2. Ciągły wlew in vivo niskiej dawki IL-2 powoduje stężenie IL-2 w surowicy pM i znaczącą, selektywną ekspansję komórek NK CD56bright, ale dopiero po 4. 6 tygodniach terapii (Tabela 1) (5). Komórki NK CD56bright wykazują szybką odpowiedź proliferacyjną na stężenia pIL rL-2 podczas krótkotrwałej (72. 96 godzin) hodowli in vitro (3, 4), ale nie odnotowano proliferacji w wydłużonych hodowlach. Komórki NK CD56bright hodowano przez 12 dni w pożywce zawierającej 100 .M rIL-2, którą wymieniano co 72 godziny. W powtórzonych doświadczeniach populacja komórek NK CD56bright początkowo wykazywała znaczny wzrost włączania 3H-TdR, który osiągnął maksimum w ciągu 4. 6 dni, a następnie stopniowo spadał do poziomów wyjściowych w dniu 10 (Figura 1a). Zgodnie z wbudowaniem 3H-TdR, barwienie komórek barwnikiem Hoechsta wykazało mniej niż 2% komórek NK CD56bright w cyklu w dniu (dane nie pokazane), ale ponad 20% komórek NK CD56bright w fazie G2 / M cykl komórkowy po 4 dniu hodowli w rIL-2. Warto zauważyć, że 42. 59% komórek NK CD56bright znaleziono w obrębie piku hipodiploidalnego, charakterystycznego dla komórek podlegających zaprogramowanej śmierci komórkowej (Figura 1a, wkładka). Odpoczynek limfocytów T lub komórek NK CD56dim nie ulega proliferacji w odpowiedzi na 100 .M samej IL-2 (3). Figura (a) 12-dniowa inkorporacja 3H-TdR komórek NK CD56bright hodowanych w 100 pM rIL-2. Świeżo wyizolowane komórki NK CD56bright (> 97% czystości) wysiano na 96-studzienkowych płytkach i hodowano w pożywce zawierającej 100 .M rIL-2, jak opisano w Methods. Komórki testowano pod kątem włączenia 3H-TdR co 48 godzin. Każdy punkt czasowy reprezentuje średnią cpm. SEM potrójnych studzienek. Wstawka: Histogram komórek NK CD56bright barwionych Hoechst hodowano przez 4 dni z pożywką zawierającą 100 pM rIL-2. Liczbę komórek mierzy się wzdłuż rzędnej, zawartość DNA wzdłuż odciętej. Zebrano i przeanalizowano pięć tysięcy zdarzeń. Liczba powyżej znacznika regionu (22%) wskazuje procent komórek w fazie G2 / M cyklu komórkowego. Około 45% komórek znaleziono w hipodiploidalnym obszarze histogramu, zwykle wskazującym na apoptozę. (b) Wyliczenie komórek NK CD56bright przez wykluczenie żywego barwnika podczas 12-dniowej hodowli w pożywce uzupełnionej lub bez 100 pM rIL-2. Przedstawione wartości reprezentują średnią. SEM odczytów wykonanych w potrójnych dołkach. Liczba ta jest reprezentatywna dla czterech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych na posortowanych komórkach CD56bright od czterech normalnych osobników. Tabela Analiza cyklu komórkowego podzbiorów limfocytów przed i podczas terapii niską dawką IL-2 Testy oznaczania liczby komórek przeprowadzono z wykorzystaniem istotnego wykluczenia barwnika w dniach 2, 6 i 12 hodowli w celu dalszej oceny frakcji CD56bright reagującej na IL-2 (3; Komórki NK. Brak komórek NK CD56bright hodowanych w nieobecności rIL-2 przeżyło po dniu 6 (Figura 1b). Przeciwnie, komórki hodowane w obecności 100 pM rIL-2 wykazały 60. Spadek liczby o 4,3% w ciągu pierwszych 6 dni hodowli, ale bez znaczącego spadku po nim aż do dnia 12. Tak więc, znaczny spadek w włączaniu 3H-TdR obserwowany w komórkach NK CD56bright między dniami 6 i 12 hodowli w rIL-2 był nieuwzględniane przez ciągły spadek bezwzględnej liczby komórek lub wzrost liczby śmierci komórek. Rzeczywiście, ogromna większość śmierci komórek po aktywacji IL-2 występuje podczas pierwszych 6 dni hodowli, gdy proliferacja jest maksymalna (Figura 1). Jądra hipodiploidalne obserwowane podczas barwienia Hoechst podczas pierwszych 6 dni hodowli (wstawka, Figura 1a) przedstawiają rozszczepiony DNA, charakterystyczny dla apoptozy (14). Zostało to potwierdzone przez bezpośrednią wizualizację DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, która wykazała drabinkowanie DNA charakterystyczne dla apoptozy (dane nie przedstawione)
[hasła pokrewne: pytania do zlotych mysli, pekajace piety, przychodnia pruszcz gdański ]
[więcej w: boję się jeździć samochodem, pekajace piety, mediq legionowo cennik ]