Skip to content

Potencjalne mechanizmy ekspansji ludzkich komórek NK w warunkach in vivo podczas leczenia niską dawką IL-2 czesc 4

1 tydzień ago

765 words

Tak więc, chociaż frakcja komórek NK CD56bright proliferowała podczas pierwszych 6 dni hodowli, frakcja komórek NK CD56bright również podlegała zaprogramowanej śmierci komórkowej. Następnie zbadaliśmy, czy komórki NK CD56bright ulegające proliferacji w odpowiedzi na rIL-2 były również komórkami przechodzącymi zaprogramowaną śmierć komórki. Komórki przechodzące przez cykl komórkowy zawierają analog Brymu tymidyny w sposób proporcjonalny do liczby razy, kiedy komórka przeszła cykl komórkowy. Równocześnie komórkową zawartość DNA można ocenić przez barwienie PI. Jądro apoptotyczne barwione PI pojawia się na czerwonym kanale fluorescencji jako populacja wykazująca hipodiploidalne DNA, które można łatwo odróżnić od normalnego diploidalnego lub hiperdiploidalnego szczytu żywych komórek (16). Figura 2a przedstawia doświadczenie kontrolne, w którym komórki CD56bright analizowano po 6 dniach hodowli w pożywce zawierającej 10% HAB bez IL-2. Po przeprowadzeniu z komórkami CD56bright NK inkubowanymi w obecności 100 pM IL-2 przez 6 dni, frakcja komórek pozostających w spokoju podczas testu znajdowała się w obrębie hipodiploidalnej lub apoptotycznej frakcji (Figura 2b). Żadna z komórek zawierających BrdU, a zatem nie przechodzących przez cykl komórkowy, nie zawierała frakcji hipodiploidalnej. Tak więc, część komórek CD56bright, które nie reagowały na sygnał proliferacyjny IL-2 również podlegała zaprogramowanej śmierci komórkowej i odpowiedzialna za spadek liczby komórek obserwowany podczas wczesnej hodowli komórkowej w IL-2. Sugerowało to, że komórki NK CD56bright pierwotnie proliferujące w odpowiedzi na IL-2 podczas pierwszych 6 dni hodowli stanowiły większość komórek, które pozostały żywe, a mimo to spoczynkowe podczas przedłużonej (tj. 12-dniowej) hodowli komórkowej (Figura 1). Komórki NK CD56bright, które przeżyły bez cyklizacji podczas przedłużonej hodowli komórkowej wymagały wiązania IL-2 z IL-2R o wysokim powinowactwie. w celu zapobiegania zaprogramowanej śmierci komórki, ponieważ dodatek neutralizującej anty-IL-2 polysera lub anty-IL-2R. mAb powodowało ponad 90% śmierć komórek w 10 dniu w powtarzanych eksperymentach (dane nie pokazane). Figura 2Korelacja apoptozy i proliferacji stymulowanych IL-2 (3 komórek NK CD56bright, jak oceniono za pomocą testu PI / BrdU. Przedstawiono reprezentatywne wykresy konturowe posortowanych komórek NK CD56bright hodowanych w nieobecności (a) lub obecności (b) 100 pM IL-2 przez 6 dni i testowane jak opisano w Metodach. Inkorporacja BrdU (aktywność proliferacyjna) mierzona jest na odciętej (fluorescencja FITC). Intensywność fluorescencji PI (zawartość DNA) mierzona jest wzdłuż rzędnej (czerwona fluorescencja). Komórki, które przeszły apoptozę, wykazują hipodiploidalny dopełniacz DNA i spadają poniżej przerywanego poziomego dzielnika. Normalne (żywe) diploidalne komórki znajdują się między kreskowanymi i pełnymi liniami poziomymi. W nieobecności IL-2 (a) nie ma dowodów na inkorporację BrdU, a zdecydowana większość komórek NK CD56bright znajduje się we frakcji hipodiploidalnej do dnia 6. W obecności IL-2 (b), frakcja komórek rozmnażają się, zawierają BrdU, a zatem są widoczne na prawo od pionowego dzielnika. Apoptoza wystąpiła tylko w niedobrym ułamku komórek (po lewej, poniżej linii przerywanej). Jest to reprezentacja trzech niezależnych eksperymentów o podobnych wynikach. Komórki NK CD56bright ekspandowane w hodowli są funkcjonalnymi komórkami efektorowymi odpornościowego wrodzonego. Następnie ocenialiśmy funkcję komórek NK CD56bright, które hodowano przez 12 dni w obecności IL-2. IL-2 (1 nM) plus IL-12 (10 U / ml) dodano do tych w inny sposób niemanipulowanych kultur komórek NK w dniach 2, 6 i 12 i IFN-y. wytwarzanie mierzono w supernatantach hodowli 2 dni po dodaniu IL-12 (Figura 3a). Komórki NK hodowane w obecności 100 pM IL-2 utrzymywały zdolność do wytwarzania IFN-y. w ciągu 12-dniowego okresu hodowli w odpowiedzi na IL-2 + IL-12, podczas gdy hodowani w samej pożywce nie mieli IFN-y produkcja w odpowiedzi na IL-2 + IL-12. Jako kolejną miarę żywotnej funkcji komórek NK oceniano również funkcję cytotoksyczną w ciągu 12-dniowej hodowli w obecności lub nieobecności 100 pM IL-2. Ponownie, komórki CD56bright hodowane w obecności IL-2 utrzymywały znaczącą aktywność cytotoksyczną, podczas gdy komórki hodowane w nieobecności IL-2 nie wykazywały żadnej zdolności do lizy komórek docelowych (Figura 3b). Figura 3 Komórki CD56 jaskrawe hodowane w 100 pM IL-2 zachowują zdolność funkcjonalną względem hodowli w samej pożywce. (a) wytwarzanie IFN-y z komórek NK; w odpowiedzi na stymulację IL-2 plus IL-12. Dwadzieścia tysięcy komórek CD56 jaskrawych na studzienkę wysiano w obecności lub nieobecności 100 pM IL-2. W dniach 2, 6 i 12 dodano IL-2 (1 nM) i IL-12 (10 U / ml), a po 2 dniach supernatanty zebrano i analizowano na obecność IFN-y. za pomocą testu ELISA
[więcej w: płatki drożdżowe przepisy, naturalne przyciemnianie włosów, azotyny w moczu przyczyny ]
[przypisy: pytania do złotych myśli, luxmed mehoffera, pulneo na kaszel ]