Skip to content

Regeneracja niedokrwiennego mięśnia sercowego i śródbłonka naczyniowego przez dorosłe komórki macierzyste ad

2 miesiące ago

583 words

Te komórki macierzyste dodatkowo testowano pod kątem ekspresji c-Kit za pomocą zestawu anty-Kit Ab (2B8, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) i dla ekspresji PECAM-1 (CD31) z anty-CD31-biotyną (MEC 13, 3, PharMingen), a następnie barwienie streptawidyną-fikoerytryną (streptawidyna-PE) (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Ekspresję białka Tie-2 określono przez barwienie Hoechst 33342, a następnie barwienie di-a-D-galaktopiranozydem (FDG) fluoresceiny (Molecular Probes Inc.) całego szpiku kostnego myszy z ekspresją genu lacZ pod kontrolą Tie-2. promotor, FVB / N-TgN (TIE2LacZ) 182 Sato (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) (14). Sortowanie i analizę komórek SP przeprowadzono na urządzeniu z potrójnym laserem (MoFlow; Cytomation Inc., Fort Collins, Colorado, USA). Do wzbudzenia barwnika Hoechsta użyto laser argonowy dostrojony do emisji 350 nm. Emisję fluorescencji zebrano za pomocą filtra pasmowego 405/30 (Hoechst blue) i filtra 670/40 BP (Hoechst red). Drugi laser o długości 488 nm został użyty do wzbudzenia PE i FITC. Czystość komórek SP w posortowanych próbkach była rutynowo większa niż 91%. Figura Analiza ekspresji genów komórek SP szpiku kostnego. (a) Normalny mysi szpik kostny jest barwiony barwnikiem Hoechst 33342. Wskazana populacja SP zawiera około 0,05% wszystkich komórek szpiku kostnego. (b) Większość komórek SP jest pozytywna dla markerów c-Kit i PECAM-1. (c) Analiza RT oczyszczonych komórek SP. m, marker; VE-CAD, VE-kadheryna; FVIII, czynnik VIII. Ekstrakcja RNA i analiza RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano z oczyszczonych komórek SP z myszy C57BL / 6-Ly-5.1, stosując Tri-Reagent (Sigma-Aldrich). Około 100 ng całkowitego RNA traktowano DNAase (Life Technologies Inc.) i stosowano w reakcji pierwszej nici, która obejmowała startery oligo dT i odwrotną transkryptazę Superscript (Life Technologies Inc.). Zagnieżdżony PCR przeprowadzono na cDNA w następujących warunkach: 94 ° C minuta, 60 ° C minuta, 72 ° C minuta przez 35 cykli. Pięć mikrolitrów pierwszej reakcji PCR zastosowano jako matrycę w zagnieżdżonej reakcji PCR. Zastosowano następujące startery: angiopoetyna-1 (580 bp), 5a-CAGTGGCTGCAAAAACTTGA-3. do przodu, 5. -TCTGCACAGTCTCGAAATGG-3. rewers; angiopoetyna-2 (666 bp), 5-CACACTGACCTTCCCCAACT-3. do przodu, 5. -TGGTGTCTCTCAGTGCCTTG-3. rewers; Tal-1 (984 bp), 5a-GTCCTCACACCAAAGTAGTG-3. naprzód, 5. -AAACTAAGCAAGAATGAGATC-3. rewers; Tie-1 (300 pz), 5-ACCCACTACCAGCTGGATGT-3. naprzód, 5. -ATCGTGTGCTAGCATTGAGG-3. rewers; Tie-2 (414 bp), 5a-CCTTCCTACCTGCTA-3. forward-1, 5. -CCGTGGACAGGGGAGATAAT-3. forward-2, 5. -CCACTACACCT-TTCTTTACA-3. rewers; ICAM-2 (320 bp), 5. -CATATGGTCCGAGAAGCAGA-3. do przodu, 5. -TGCACTCAATGGTGAAGTCT-3. rewers; VE-kadheryna (520 bp), 5a-TTGCCCAGCCCTAGCAACCTAAAG-3. do przodu, 5a-ACCAC-CGCCCTCCTCATCGTAAGT-3. rewers; vWF (1097 bp), 5a-ATGATGGAGAGGTTACACATC forward-1, 5a-GCGCATCCGCGTGGCAGTGG-3. forward-2, 5. -GGCAGTTGCAGACCCTCCTTG-3. rewers; FVIII (400 bp), 5a-GTCCCTACTCCTTCTATTCTAGCC-3. forward-1, 5. -CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3. forward-2, TCATCATAGGTGTGGATGAGTCCTG-3. rewers; VEGF-A (620, 548, 488 bp), 5 (3-GGATCCATGAACTTTCTGCT-3. forward-1, 5. -GGGTGCACTGGACCCTGGCT-3. forward-2, 5. -GAATTCACCGCCTCGGCTTGTC-3. rewers; Flk-1 (537 bp), 5a-GCCAATGAAGGGGAACTGAAGAC-3. do przodu, 5. -TCTGACTGCTGGTGATGCTGTC-3. rewers; Flt-1 (504 bp), 5a-TGTGGAGAAACTTGGTGACCT-3. do przodu, 5. -TGGAGAACAGCAGGACTCCTT-3. rewers; mięsień gładki (3-aktyny (240 bp), 5a-GAGAAGCCCAGCCAGTCG-3. do przodu, 5. -CTCTTGCTCTGGGCTTCA-3. rewers; kalponina (213 pz), 5a-CACCAACAAGTTTGCCAG-3. forward, 5. -TGTGTCGCAGTGTTCCAT-3. rewers; desmin (377 bp), 5a-ATGAGCCAGGCCTACTCGTC-3. naprzód, 5. -GCGCACCTTCTCGATGTAGT-3. rewers; (3 -actinin (976 bp), 5a-TGCTGCTATGGTGTCAGAGG-3. naprzód, 5. -CCGATCATTGACGTTCACAG-3. rewers. Przeszczep szpiku kostnego i niedrożność serca. Samice myszy C57BL / 6-Ly-5.1 napromieniano (9 Gy) i wstrzyknięto 2000 komórek SP izolowanych z samców myszy C57BL / 6-Rosa-Ly-5.2. Wszczepienie, które mieściło się w zakresie 35-85%, zostało określone przez analizę krwi obwodowej przy użyciu Abs wobec Ly-5.2 (klon 104, PharMingen) lub barwienie FDG dla ekspresji lacZ (Molecular Probes Inc.), po czym przeprowadzono analizę FACS. Około 10 tygodni po transplantacji szpiku, lewa przednia tętnica wieńcowa każdej myszy została zamknięta na 60 minut, a następnie reperfuzja, jak opisano wcześniej (15). Dwa lub cztery tygodnie po uszkodzeniu serca serca usunięto i zamrożono do analizy immunohistochemicznej. Po 2 i 4 tygodniach wskaźnik przeżycia wynosił 26%. Pięćdziesiąt trzy procent myszy przeżyło co najmniej tydzień, a 80% przeżyło co najmniej 24 godziny reperfuzji po 1-godzinnej okluzji, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami. Analiza immunohistochemiczna
[patrz też: pharmaceris h stimupurin, olej lniany budwigowy oleofarm, azotyny w moczu ]
[hasła pokrewne: azotyny w moczu, medicor gliwice, nk w komórce ]