Skip to content

Regeneracja niedokrwiennego mięśnia sercowego i śródbłonka naczyniowego przez dorosłe komórki macierzyste cd

2 miesiące ago

701 words

Zamrożone skrawki (12 .m) tkanki eksperymentalnej utrwalono 4% paraformaldehydem przez 30 minut w 4 ° C. Barwienie LacZ przeprowadzono przez noc w 37 ° C z następującymi odczynnikami: 5 mM żelazocyjanku potasu, 5 mM żelazicyjanku potasu, 2 mM MgCl2, 0,01% dezoksycholanu sodu, 0,02% Nonidet P-40 (NP-40) i mg / ml X-gal (Life Technologies Inc.). Tkanki następnie przemyto w PBS i wybarwiono specyficznymi Ab. Do identyfikacji mięśnia sercowego stosowano anty-aktynę (klon EA-53, Sigma-Aldrich), podczas gdy anty-Flt-1 (klon C-17, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) i anty . ICAM-1 (hojnie dostarczony przez Alana Burnsa, Baylor College of Medicine) wykorzystano do rozpoznawania komórek śródbłonka. Komórki hematopoetyczne wizualizowano za pomocą anty-Ly-5-biotyny (klon 30-F11; PharMingen). Drugorzędowe Ab były skoniugowane z Alexa 488, Alexa 546 lub Alexa 594 (wszystkie z firmy Molecular Probes Inc.). Skrawki wybarwionych tkanek przygotowano i analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i różnicowej kontrastowej interferencji. Niektóre skrawki pokryto antimakrofagiem Ab, F480 (Serotec Ltd., Oxford, Wielka Brytania), który wykryto za pomocą zestawu Vector Laboratories (Burlingame, Kalifornia, USA) zawierającego barwnik z biotynylowanym drugorzędowym anty-szczurem, a następnie kompleks awidyna-biotyna opracowany za pomocą 3,3-diaminobenzydyny (DAB) z Vector Labs; barwienie kontrastowe było eosinem. Wyniki SP mysich komórek macierzystych szpiku kostnego wybranych przez wybarwienie barwnikiem Hoechst (Figura 1a) jest wysoce wzbogaconą hematopoetyczną populacją komórek macierzystych, która może wytworzyć wszystkie linie krwiotwórcze u myszy (10, 11). Aby zademonstrować wkład komórek SP w naprawę tkanek niehematopoetycznych, najpierw testowaliśmy ekspresję markerów prymitywnych i całkowicie zróżnicowanych komórek śródbłonka i kardiomiocytów. Jak pokazano na Figurze 1b, samoistnie SP-dodatnie SP-C również wyrażały PECAM-1 (CD31), który wcześniej uważano za ograniczony do angioblastów, komórek śródbłonka, megakariocytów i płytek krwi. Analiza RT-PCR RNA z oczyszczonych komórek SP (figura 1c) nie pozwoliła na wykrycie wspólnych markerów mięśnia sercowego (desminy i (3-aktyniny), zróżnicowanych naczyniowych komórek śródbłonka (ICAM-2, kadheryna VE, vWF i czynnik VIII), i wczesne śródbłonkowe komórki progenitorowe (Flk-1 i Flt-1, receptory dla VEGF). Jednak komórki SP eksprymowały gen Tie-2, który koduje receptor dla angiopoetyn i 2. To stwierdzenie zostało potwierdzone przez badanie ekspresji lacZ w komórkach SP myszy, która eksprymowała ten gen pod kontrolą Tie-2. promotor / wzmacniacz (dane nie pokazane) (14, 16). Oczyszczone komórki SP również wykazywały ekspresję wczesnego czynnika transkrypcyjnego hematopoetycznego / śródbłonkowego Tal-1 / SCL, jak również trzech izoform VEGF-A i angiopoetyny-1 (Ang-1). We wszystkich przypadkach pozytywności markerowej sygnał RT-PCR był obecny w trzech z trzech pojedynczych preparatów oczyszczonych komórek SP. Tożsamości produktów PCR zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA. Aby ocenić wkład komórek SP w naprawę uszkodzonego mięśnia sercowego, zastosowaliśmy transplantację szpiku kostnego oraz model zamknięcia / reperfuzji serca (ryc. 2). Dwadzieścia dwie myszy C57Bl / 6 poddano promieniowaniu letniskowemu i przeszczepiono komórkami SP oczyszczonymi ze szpiku kostnego 6-do 8-tygodniowych dorosłych myszy C57Bl / 6-Rosa26, szczepu, w którym gen lacZ ulega ekspresji w szerokim zakresie (17). ). Dziesięć do dwunastu tygodni po transplantacji lewą przednią tętnicę wieńcową zstępującą zamykano na godzinę i poddawano reperfuzji. Dziewiętnaście myszy leczono, a pozorowane operacje wykonywano na trzech zwierzętach. Myszy uśmiercono 2 lub 4 tygodnie po uszkodzeniu w celu analizy serc w celu włączenia komórek SP lub ich potomstwa do regenerujących się tkanek. Pięć myszy (26%), które przeszły okluzję / reperfuzję tętnicy wieńcowej, przetrwało do końca eksperymentu, a śmiertelność była zgodna z wcześniejszymi obserwacjami (15). Rysunek 2 Scenariusz eksperymentalny. Komórki SP oczyszczono ze szpiku kostnego (BM-SP) otrzymanego z myszy transgenicznych C57B1 / 6-Rosa26. Komórki te zostały przeszczepione na śmiertelnie napromienionych biorców. Po 2 miesiącach ustalono stabilność wszczepienia przez ustalenie obecności komórek krwi obwodowej dodatnich dla lacZ. Silnie wszczepione zwierzęta poddano podwiązaniu tętnic wieńcowych przez 60 minut, a następnie reperfuzji. Dwa do czterech tygodni później zwierzęta, które przeżyły, uśmiercono w celu analizy włączenia lacZ do tkanki sercowej. Serie myszy, które przeżyły przez 2 lub 4 tygodnie po uszkodzeniu podzielono na fragmenty, wybarwiono X-galem, a następnie fluorescencyjnymi Ab i skanowano w celu włączenia przeszczepionych komórek do regenerujących tkanek.
[przypisy: przychodnia łucznicza szczecin, ciasteczka z wróżbą teksty, azotyny w moczu przyczyny ]
[przypisy: specjalistyka czechów, durszlak czy druszlak, przychodnia łucznicza szczecin ]