Skip to content

Selektywność kompetentnego pod względem replikacji adenowirusa dla ludzkich komórek raka sutka eksprymujących antygen MUC1 ad

3 tygodnie ago

124 words

Komórki ZR-75-1 hodowano w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 25 mM HEPES. Linie komórkowe BT-20 i PA-1 hodowano w MEM Eagle a. Wszystkie pożywki uzupełniono 10% dezaktywowanym termicznie FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 ug / ml streptomycyny. Struktura adenowirusa zdolnego do replikacji promotora DF3. Część genu E1 o wielkości 480 pz wytworzono z pKSCMVE1 (16) przy użyciu starterów A2s (475) XS (5a-GGACTAGTAAGCTTCTCCAGCCCGTGAGTTCCTCAAGAGG-3P) i A2a (921) NS (5a-TCCCCCGGGCTAGCATCGATCACCTCCGGCACAA-3a). Fragment o wielkości 480 pz strawiono enzymami restrykcyjnymi SpeI i SmaI, a następnie zligowano z pAdClxB (plazmid 1) (16). Region promotora DF3 amplifikowano z pDF3 stosując starter DF3.5. (5. -TCTAGACTAGTGTGGACCCTAGGGTTCATCGGAG-3.) I DF3.3. (5a-AACTCGAGGATTCAGGCAGGCGCTGGCT-3.). Uzyskany fragment 780-bp zligowano z plazmidem przy użyciu miejsc restrykcyjnych SpeI i XhoI w celu wytworzenia plazmidu 2. Pozostałą sekwencję E1A (<5 kb) strawiono z regionu pKSCMVE1 i wklonowano w plazmid 2 przy użyciu komplementarnych miejsc restrykcyjnych ClaI (pDF3). -E1 / CMV). Następnie usunięto sekwencję promotorową wirusa cytomegalii (CMV) w celu wytworzenia pDF3-E1, który zawiera promotor DF3 do kierowania genem E1A. Plazmid markerowy skonstruowano przez wstawienie cDNA zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) do pDF3-E1 / CMV w miejscu BamHI (pDF3-E1 / CMV-GFP). Konstrukcję pDF3-E1 / CMV-TNF przeprowadzono przez podstawienie GFP sekwencją cDNA TNF (17). Replikacyjnie kompetentny adenowirus pod kontrolą promotora DF3 wytworzono standardowymi technikami rekombinacji homologicznej z użyciem plazmidu adenowirusowego pJM17 (dostarczonego przez F. Grahama, McMaster University, Hamilton, Ontario, Kanada) w komórkach HEK 293. Trzy mikrogramy każdego plazmidu wahadłowego zmieszano z 6 .g pJM17 i wytrącono CaCl2. Zostało to użyte do transfekcji komórek HEK 293. Rekombinowany adenowirus wyizolowano z pojedynczej łysinki i ekspandowano w komórkach HEK 293. DNA oczyszczono i analizowano za pomocą PCR. Wirus przygotowano przez zakażenie osiemdziesięciu 15-cm płytkami komórek HEK 293 i zebranie oderwanych komórek po 48 godzinach. Wirus pozostał związany z komórkami. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 400 g przez 5 minut w 4 ° C. Komórki ponownie zawieszono w 10 ml zimnego PBS (wolnego od Ca2 + i Mg2 +) i poddano lizie w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 1500 g przez 10 minut w 4 ° C. Supernatant umieszczono na gradiencie przygotowanym z równych części CsCl w PBS (1,45 g / ml i 1,20 g / ml), a następnie wirowano przez 2 godziny przy 15 000 g w 12 ° C. Pas wirusa usunięto, ponownie spieniono w uprzednio utworzonym gradiencie CsCl przez ultrawirowanie przez 18 godzin i dializowano do zimnego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) zawierającego 10 mM MgCl2 i 10% glicerolu. Miana oczyszczonego adenowirusa określano za pomocą spektrofotometrii i testów łysinkowych. Plazmidy wahadłowe pCMV-LacZ i pCMV-TNF zastosowano do wytworzenia zrekombinowanych adenowirusów Ad.CMV. - gal i Ad.CMV-TNF, w których ekspresję LacZ lub TNF steruje promotor CMV. Ad.DF3. - gal przygotowano jak opisano (15). Pośrednia analiza immunofluorescencyjna antygenu MUC1. Komórki (2x105) przemyto intensywnie zimnym PBS, inkubowano z mAb DF3 (1 .g / ml) w 4 ° C przez godzinę i przemyto zimnym PBS. Komórki inkubowano ze skoniugowanym z FITC kozim anty-mysim IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) w 4 ° C przez godzinę, przemywano zimnym PBS, a następnie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Intensywność fluorescencji określono dla 10 000 komórek. Analiza Western błot ekspresji Ad2 E1A i Ad5 E1B. Trzy dni po infekcji wirusowej komórki poddano lizie w buforze do lizy komórkowej (50 mM HEPES przy pH 7,5, 0,15 M NaCl, mM EDTA, 1% NP-40, mM PMSF, 10 mM NaF, 10 ng / ml aprotyniny, 10 ng / ml leupeptyny, mM DTT i mM wanadanu sodu), inkubowano przez 30 minut na lodzie i odwirowywano przy 1500 g przez 10 minut w 4 ° C. Supernatanty przeniesiono do probówek Eppendorfa i ogrzewano w 100 ° C przez 5 minut. Białko analizowano przez immunoblotting z mAb Ad2 E1A lub Ad5 E1B (1 .g / ml; Oncogene Research Products, Cambridge, Massachusetts, USA). Reaktywność została zwizualizowana przez ulepszoną chemiluminescencję (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). Test replikacji wirusa in vitro. Jednowarstwowe hodowle komórkowe w 24-studzienkowych płytkach (5 x 104 komórek / dołek) zakażono Ad.DF3-E1, Ad.DF3-E1 / CMV, Ad.DF3-E1 / CMV-TNF lub Ad5 typu dzikiego w moi 1.0 jednostek tworzących łysinki (pfu) na studzienkę. Wirusa inocula zostały usunięte po 2 godzinach. Komórki następnie przemyto dwukrotnie PBS i inkubowano w 37 ° C przez różne okresy czasu [podobne: kiedy szczepić na pneumokoki, sanatorium goczałkowice zdrój, najlepsza pozycja do spania ] [hasła pokrewne: boję się jeździć samochodem, pekajace piety, mediq legionowo cennik ]