Skip to content

Selektywność kompetentnego pod względem replikacji adenowirusa dla ludzkich komórek raka sutka eksprymujących antygen MUC1 cd

4 dni ago

768 words

Lizaty przygotowano w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Seryjne rozcieńczenia lizatów miareczkowano na komórkach HEK 293. Testy działania cytopatycznego. Komórki przygotowano 24 godziny przed zakażeniem adenowirusami we wskazanym moi. Fotomikrografy wykonano w dniach 3, 5 i 7 po zakażeniu. ELISA. W dniach 1, 3, 5 i 7 po infekcji wirusowej supernatanty badano na poziomy TNF przy użyciu zestawu ELISA dla ludzkiego martwicy nowotworów z Sigma Chemical Co. Przenoszenie genu in vivo do heteroprzeszczepów ludzkiego raka sutka. Samice bezgrasiczych myszy nagich (Taconic Farms, Germantown, New York, USA) w wieku 5. 6 tygodni wszczepiono podskórnie peletem estradiolu-17. (1,7 mg, 60-dniowe uwalnianie, Innovative Research of America, Sarasota, Floryda, USA) dzień przed inokulacją nowotworu. Guzy ustalono przez podskórne wstrzyknięcie 107 komórek MCF-7 lub komórek MDA-MB-231 w 0,2 ml 50% Matrigel (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA) i 50% PBS w bokach myszy. . Guzy pozostawiono do wzrostu do około 6. 7 mm średnicy. W przypadku wstrzyknięcia do guza, wstrzyknięto 30 .l zawiesiny wirusa w PBS przy użyciu igły 25 G. Guzy mierzono we wskazanym czasie po iniekcji w ich najdłuższym wymiarze i pod kątem 90 stopni względem tego pomiaru. Objętości guza obliczono stosując następujący wzór: (długość x szerokość2) / 2. Objętość guza znormalizowano do 100% w dniu 0 (V / V0). Wyniki wyrażono jako ułamkową objętość guza (średnia . SD). Istotność statystyczną oceniano za pomocą testu ucznia. Analiza histopatologiczna. W 4-5 tygodni po wszczepieniu nowotworu, do ksenoprzeszczepów guza MCF-7 wstrzyknięto do 2 x 108 pfu oczyszczonego adenowirusa za pomocą strzykawki Hamiltona z igłą 26 G. Igła została pokryta drobnymi cząstkami węgla drzewnego, aby zaznaczyć ślad igły. Guzy podzielono na fragmenty w celu analizy ekspresji genów reporterowych. Wyniki Selektywna replikacja adenowirusa w komórkach MUC1-dodatnich in vitro. Aby zbudować adenowirus, który selektywnie replikuje w komórkach MUC1-dodatnich, umieściliśmy promotor DF3 / MUC1 powyżej regionu E1. Ad.DF3-E1 skonstruowano przez wstawienie kasety ekspresyjnej w usuniętym regionie E1 wirusa Ad5 defektywnego pod względem replikacji (Figura 1). Rysunek Struktura Ad.DF3-E1. ITR, odwrócenie kolejności końcowej; mu, jednostka mapy. Do oceny selektywności replikacji wirusa Ad.DF3-E1 zastosowano ludzkie linie komórkowe. Jak określono za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałem anty-MUC1, komórki raka sutka MCF-7, ZR-75-1 i BT-20 eksprymowały MUC1 (Figura 2a). Natomiast komórki raka piersi MDA-MB-231 i komórki raka jajnika PA-1 wykazywały niewielką ekspresję MUC1 lub były używane jako kontrole (Figura 2a). Co więcej, ekspresja MUC1 była wykrywalna, ale zmniejszona, w komórkach nabłonkowych Hs578Bst w porównaniu z komórkami w liniach komórkowych raka sutka (Figura 2a). Komórki infekowano Ad.DF3-E1 w moi wynoszącym 10 przez okres 2 godzin, a następnie przemywano i ponownie zawieszano w pożywce. Ekspresję białka E1A oceniano za pomocą analizy immunoblot. Wyniki wykazują ekspresję E1A w komórkach MCF-7 i ZR-75-1 dodatnich pod względem MUC1, ale nie w komórkach MDA-MB-231 i PA-1 ujemnych pod względem MUC1 (Figura 2b). Występowała także niewielka wykrywalna ekspresja E1A w komórkach Hs578Bst zakażonych Ad.DF3-E1 (Figura 2b). Jako kontrole, komórki były również infekowane wirusem Ad5 wykazującym ekspresję av wirusa Ad5 pod kontrolą wirusa CMV (Ad.CMV. – gal) lub Ad5 typu dzikiego. Podczas gdy nie było wykrywalnej ekspresji E1A w komórkach zakażonych Ad.CMV. – gal, E1A ulegał ekspresji przez każdą z komórek zakażonych Ad5 typu dzikiego (Figura 2b). Ekspresję genu E1B można było również wykryć w komórkach MUC1-dodatnich, ale nie w MUC1-ujemnych, komórki zakażone Ad.DF3-E1 (figura 2c i dane nie przedstawione). Odkrycia te wskazują, że zakażenie Ad.DF3-E1 powoduje selektywną ekspresję E1A w komórkach raka sutka. Figura 2 Selektywna ekspresja E1A w komórkach MUC1-dodatnich zakażonych Ad.DF3-E1. (a) Wskazane komórki inkubowano z mAb DF3 (obszar otwarty) lub izotypowo identycznym kontrolnym Ab (obszar zacieniowany), a następnie poddawano analizie metodą cytometrii przepływowej. (b) Komórki zostały zainfekowane Ad.DF3-E1, Ad.CMV – gal lub Ad5 typu dzikiego. Lizaty z komórek kontrolnych (niezakażonych) i zakażonych poddano analizie immunoblot z użyciem Ab anty-E1A. (c) Lizaty z komórek zainfekowanych Ad.DF3-E1a poddano analizie immunoblot z anty-E1B. Wirusowe miana oceniano badając tworzenie płytki w celu oceny replikacji Ad.DF3-E1 w różnych liniach komórkowych. W komórkach MCF-7 pozytywnych pod względem MUC1, komórkach ZR-75-1 i komórkach BT-20, Ad.DF3-E1 replikuje się na poziomach porównywalnych z Ad5 typu dzikiego (Figura 3).
[przypisy: gorące szesnastki, kiedy szczepić na pneumokoki, wyszukiwarka sanatorium nfz ]
[więcej w: pytania do złotych myśli, luxmed mehoffera, pulneo na kaszel ]