Skip to content

Wzdłużna nieinwazyjna oparta na PET oszacowanie masy komórek w spontanicznym modelu szczurzej cukrzycy ad 6

1 miesiąc ago

716 words

Szczurze trzustki wycięto, utrwalono w PBS / 10% formalinie i zatopiono w parafinie. Skrawki o grubości pięciu mikrometrów odparowano i wybarwiono H & E. Skrawki barwiono także przeciwciałami insuliny przeciw bydlęcej świnki morskiej z Sigma-Aldrich i opracowywano standardowymi metodami immunohistochemii pośredniej. Obrazy z 5 szkiełek na trzustkę (przekroje pobrane w odstępach 500. M) rejestrowano za pomocą mikroskopu optycznego Leica Microsystems DM E wyposażonego w aparat cyfrowy Pentax. Obszar tkanki trzustkowej, obszar wysepek, obszar komórek z insuliną i liczba wysepek zostały określone za pomocą pomiarów wspomaganych komputerowo przy użyciu oprogramowania ImageJ (wersja 1.34; NIH), które zostały skalibrowane za pomocą mikrometru scenicznego firmy Ted Pella Inc. (2 m / podział × 50 działów). Odsetek . frakcja komórkowa w trzustce została obliczona ze stosunku obszaru dodatniego pod względem insuliny do całkowitego obszaru tkanki, jak opisano wcześniej (54-56). Oznaczenie ilościowe transkryptu VMAT2 w trzustce szczurów euglicemicznych i cukrzycowych. Zbiór trzustek do całkowitego przygotowania RNA przeprowadzono w następujący sposób: znieczulone szczury otwarto z nacięciem środkowym, a wątroba, żołądek i jelito cienkie odbite w celu odsłonięcia trzustki. Jama brzuszna została następnie wypłukana 5 ml RNAlater firmy Ambion Inc. zgodnie z zaleceniami producenta. Głowa, ciało i ogon trzustki zostały podzielone na RNAlater i przeniesione na 25-milimetrową plastikową szalkę Petriego zawierającą wystarczającą ilość RNA, aby pokryć wyciętą tkankę. Trzustkę pocięto na odcinki o grubości około 2 mm, przeniesiono do świeżego RNA i przechowywano przez noc w 4 ° C. Całkowite trzustkowe RNA wyizolowano i oceniono pod kątem jakości, a specyficzną obfitość transkryptu mierzono za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej (28). Zastosowano następujące warunki: cykl w 95 ° C przez 900 sekund, a następnie 45 cykli amplifikacji (94 ° C przez 15 sekund, 55 ° C przez 20 sekund i 72 ° C przez 20 sekund). Oligonukleotydy zostały zsyntetyzowane przez Invitrogen Corp. Sekwencje starterów były następujące: 5. -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3. (. -ACT-5.); 5. -CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3. (. -ACT-3.); 5. -GCCCTGCCCATCTGGATGAT-3. (VMAT2-5.); 5. -CTTTGCAATAGCACCACCAGCAG-3. (VMAT2-3.). Względne ilości mRNA zostały obliczone metodą progu cyklu komparatywnego opisaną przez Livaka i Schmittgena (57); wartości zostały znormalizowane przez ekspresję p-aktyny. Protokół badania skanowania PET. Wyjściowe skany PET przeprowadzono na 7-tygodniowych samcach szczurów BB-DP. Po skanie podstawowym wykonano dodatkowe 2 lub 3 badania PET w okresie 12 tygodni (Tabela 1). W późniejszych eksperymentach przeprowadzono 2 dodatkowe skany PET na 8-tygodniowych lub starszych szczurach BB-DP na podstawie obecności nieprawidłowego testu tolerancji glukozy. Przed obrazowaniem zwierzęta znieczulono ketaminą ip ksylazyną. Po uzyskaniu skaningu transmisji interesującego obszaru (w celu korekcji tłumienia danych emisji) podawano radioligand [11C] DTBZ (0,5. 1,0. Ci / g) w soli fizjologicznej w postaci wstrzyknięcia bolusa przez żyłę prącia. Skany PET zwierząt uzyskano dynamicznie od 0 do 60 minut po iniekcji na Concorde microPET R4 (CTI Molecular Imaging). Skaner dostarczył pole widzenia 100 na 80 mm z odtworzoną rozdzielczością 2,25 mm w centralnym 40 mm pola widzenia. Dane PET były przetwarzane z wykorzystaniem macierzy korekcji tłumienia otrzymanej przez skany transmisji; obrazy zostały zrekonstruowane przy użyciu ponownego łączenia Fouriera, a następnie dwuwymiarowa, przefiltrowana projekcja wsteczna za pomocą oprogramowania do zarządzania microPET z CTI Molecular Imaging. Obrazowanie brzucha kobiety-pawiana przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (58) przy użyciu [11C] DTBZ. Analiza i interpretacja danych. Analizę obszaru zainteresowania (ROI) i rekonstrukcję obrazu przeprowadzono za pomocą oprogramowania ASIPro z CTI Molecular Imaging. Analiza wizualna została przeprowadzona przez osoby doświadczone w interpretacji PET za pomocą rekonstrukcji koronalnych, poprzecznych i strzałkowych. Rekonstruowane obrazy PET o grubości plastra 5 mm zastosowano do identyfikacji i pomiaru aktywności radioligandu w każdym organie będącym przedmiotem zainteresowania. Wskaźniki ROI były ręcznie umieszczane na płaszczyznach obrazów w celu wyznaczenia krzywych czas-aktywność. ROI zostały narysowane przy użyciu znanych punktów orientacyjnych, zachowując awidność [11C] DTBZ w trzustce zwierząt z cukrzycą i wyjściowy wzorzec wychwytu DTBZ [11C]. Jeden z tych punktów orientacyjnych, wątroba, jest wyraźnie widoczny w zrekonstruowanych obrazach jako miejsce katabolizmu [11C] DTBZ i wydalania do żółci (Ryc. 1). Nerki nie są pokazane na rycinie 1, ale były widoczne we wczesnych rekonstruowanych obrazach
[hasła pokrewne: sanatorium goczałkowice zdrój, azotyny w moczu przyczyny, płatki drożdżowe przepisy ]
[patrz też: gorące szesnastki, ksylazyna, epiduo żel cena ]