Skip to content

Złożona rola receptora progesteronowego w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń ad

4 tygodnie ago

721 words

Zastosowany w tym badaniu model urazu tętnicy szyjnej myszy został szczegółowo opisany wcześniej. Eksperymentalny projekt niniejszego badania pokazano na Figurze 1. Pięćdziesiąt dziewięć dorosłych samic myszy (29 PRKO, 30 WT miotów z miotu) miało wyciętą jajnicę, pozostawiono do wyzdrowienia przez 7. 10 dni, a następnie losowo przydzielono do otrzymania nośnika lub podskórnych peletek, które ciągłe uwalnianie progesteronu (35 mg) przez 21 dni (Innovative Research of America, Sarasota, Floryda, USA). Wcześniejsze badania wykazały, że owariektomie zmniejsza krążący progesteron do niewykrywalnego poziomu i że peletki progesteronu stosowane w tym badaniu wytwarzają stały i fizjologicznie istotny poziom hormonów krążących u myszy (38. 40, 42. 44). Tydzień po wszczepieniu peletek znieczulone myszy poddano jednostronnemu uszkodzeniu tętnicy szyjnej wspólnej przez intralumienny pasaż drutu cienkiego, odsłaniając śródbłonek naczyniowy i wywołując charakterystyczny wzrost obszaru przyśrodkowego i proliferacji VSMC. W tym samym dniu, co urazu tętnic szyjnych, myszom wszczepiono podskórnie osmotyczną minipompę (Alzet Inc., Palo Alto, California, USA), która w sposób ciągły uwalnia bromo-dezoksy-urydynę (BrdU; 25 mg / kg / d) w eksperyment. Rycina 1Projekt badania urazu tętnic szyjnych. Wszystkie zwierzęta poddano owariektomii (OVX), a następnie pozostawiono do wyzdrowienia na 7-10 dni. Peletki zawierające progesteron lub placebo implantowano następnie podskórnie tydzień przed urazem tętnicy szyjnej i implantacji osmotycznej mini-pompy zawierającej BrdU. W 14 dniu po urazie zwierzęta uśmiercono i obie tętnice szyjne zostały utrwalone, zebrane, a następnie zatopione w parafinie. Następnie naczynia podzielono poprzecznie i wybarwiono, aby umożliwić analizę morfometryczną i immunohistochemiczną odpowiedzi na uszkodzenie. Dalsze szczegóły tej procedury zostały opublikowane wcześniej (35. 37). Morfometria i immunohistochemia. Dwa tygodnie po urazie tętnic szyjnych zebrano naczynia i oceniono odpowiedź na uszkodzenie naczyń stosując dwa niezależne miary: proliferację VSMC, mierzoną przez immunohistochemiczne wykrywanie komórek znakowanych BrdU i obszar przyśrodkowy, mierzony komputerową morfometrią. Równoległe skrawki ze wszystkich 118 tętnic szyjnych barwiono jak opisano wcześniej dla hematoksyliny / eozyny i dla elastyny, a pomiary powierzchni wykonywano przy użyciu skomputeryzowanego systemu analizy morfometrycznej na odcinkach barwionych elastyną (35. 37). Dla każdego zwierzęcia analizowano dwie sekcje, a obszary uśredniono. Immunowybarwienie przeprowadzono również na równoległych odcinkach tętnicy szyjnej przy użyciu przeciwciał anty-BrdU, swoistych dla komórek śródbłonka Ab (antygen pokrewny czynnikowi VIII) i specyficznych wobec VSMC Ab (s-aktyny) (wszystkie z Sigma Chemical Co). St. Louis, Missouri, USA) (35. 37) w celu rozróżnienia różnych typów komórek naczyniowych. Medial VSMCs, które zostały wyznakowane BrdU były określane ilościowo zgodnie z opisem (35. 37). Komórki dopochwowe nie zostały uwzględnione w żadnej z tych analiz. Wszystkie analizy zostały wykonane przez dwóch obserwatorów nie znających mysiego genotypu i grupy leczonej. Budowa adenowirusów PR. Pełnej długości fragment cDNA kodujący ludzki PRB WT sklonowano jako fragment BamHI (częściowe trawienie, w celu zaoszczędzenia wewnętrznego miejsca BamHI w pozycji 70 ludzkiego cDNA PR) z plazmidu hPRB-pLEM do wektora wahadłowego adenowirusa pACCMV.pLpA. . Adenowirusa adeno-PRB skonstruowano przez kotransfekcję PRB-pACCMV.pLpA i pJM17 do komórek HEK293, a następnie standardową selekcję i procedury oczyszczania wirusa. Prawidłowe wstawienie odpowiedniego cDNA do wektora wahadłowego potwierdzono przez analizę sekwencji. Immunoblot. W celu potwierdzenia prawidłowej ekspresji PRB, VSMC zakażono wirusem adeno-PRB lub kontrolnym białkiem z adeno-GFP (adeno-GFP), a 24 godziny później komórki poddano lizie w następującym buforze: 20 mM Tris HCl (pH 7,5), 140 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 7,4), 50 mM fosforanu beta-glicerolu, 1% (obj./obj.) Triton X-100, 20% (obj./obj.) Glicerolu. Bezpośrednio przed użyciem do buforu do lizy dodano 1: 1000 (obj./obj.) Zestawu koktajlowego inhibitora III (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Kalifornia, USA). Całkowite białka komórkowe (25 .g) rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na błonę nitrocelulozową, inkubowano z pierwszorzędowym Ab, mysim monoklonalnym anty-PR Ab, Ab-8, w rozcieńczeniu 1: 500 (NeoMarkers Inc., Fremont , Kalifornia, USA), a następnie drugorzędowy Ab, przeciwciało przeciwko mysiej IgG przeciw peroksydazie chrzanowej (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA) i opracowano go z zastosowaniem ulepszonych technik chemiluminescencji. Dodatkowe eksperymenty przeprowadzono stosując monoklonalne przeciwciała anty-PR, Ab-7 i Ab-4 (Amersham Pharmacia Biotech) i poliklonalne przeciwciało anty-PR Ab C-19 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) . Hodowla komórek i testy proliferacji
[przypisy: naturalne przyciemnianie włosów, zaburzenie częściowe, sanatorium goczałkowice zdrój ]
[patrz też: podsłuchane w biedrze, zaburzenie częściowe, immunosan ]