Skip to content

Złożona rola receptora progesteronowego w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń cd

1 tydzień ago

482 words

Hodowane komórki zidentyfikowano jako VSMC poprzez immunobarwienie dla specyficznej dla mięśni gładkich a (3-aktyny zgodnie z instrukcjami producenta (Sigma Chemical Co.). VSMC hodowano z każdej z trzech indywidualnych myszy PRKO i WT. VSMC hodowano w wolnym od czerwieni fenolowej DMEM z 10% FBS pozbawionym estrogenu, jak opisano (45). Proliferację VSMC oceniano w warunkach wyjściowych bez stymulacji mitogennej i w obecności stymulacji FBS. W każdym doświadczeniu uwzględniono osiem powtórzeń każdego rodzaju komórek i każde doświadczenie przeprowadzono niezależnie minimum trzy razy. Testy proliferacji obejmowały komórki z każdej z trzech kultur VSMC otrzymanych niezależnie od różnych zwierząt dla każdego genotypu, a wyniki następnie połączono. W początkowych testach proliferacji VSMC komórki w pasażu 20 lub mniej wysiano na 96-studzienkowych płytkach przy gęstości 5 x 103 komórek / studzienkę. Sześć godzin po wysianiu komórki zatrzymywano wzrost przez 16 godzin w pożywce wolnej od surowicy (SFM), w którym to czasie do każdego dołka dodano 0,1. Cu / studzienkę 3H-tymidyny. Po 24 lub 48 godzinach inkubacji w SFM z 3H-tymidyną komórki przepłukano trzy razy lodowato zimnym PBS, a następnie potraktowano 5% kwasem trichlorooctowym przez 20 minut w temperaturze 4 ° C, a następnie dodano równą objętość 0,5 N NaOH. Na koniec lizat komórkowy zobojętniono przez dodanie 0,5 N HC1, zmieszano z płynem scyntylacyjnym i wielkość wychwytu 3H-tymidyny określono przez zliczenie scyntylacyjne. W celu zbadania wpływu progesteronu na proliferację VSMC stymulowanych mitogenami, VSMC pochodzące z WT i PRKO wysiewano w gęstości 20 x 103 komórek / studzienkę i inkubowano w SFM w obecności lub nieobecności progesteronu i / lub antagonisty PR. RU 486. RU 486 dodano do odpowiednich studzienek godzinę przed dodaniem progesteronu. Wszystkie studzienki traktowano tym samym stężeniem etanolu z pojazdu. Po pozostawieniu komórek na 24 godziny w stanie spoczynku, stymulowano je 1% FBS, inkubowano z 3H-tymidyną przez 24 godziny, a wielkość wychwytu 3H-tymidyny oznaczono jak opisano powyżej. W podzbiorze eksperymentów VSMC z pochodnych PRKO inkubowano z adeno-PRB lub kontrolnym wirusem adenowirusa-GFP w stężeniu moi. S od 1. 50 przez 24 godziny przed wysianiem. Następnie komórki umieszczono w SFM z progesteronem lub bez progesteronu i / lub RU 486, stymulowano 1% FBS, i wychwyt 3H-tymidyny określono jak opisano powyżej. Całkowitą liczbę komórek określono również w równoległych doświadczeniach przez ręczne zliczanie na hemocytometrze 6 godzin po wysianiu w celu zapewnienia równego powlekania WT i PRKO VSMC. Analizy statystyczne. Dla wszystkich analiz statystycznych dane najpierw poddano testom normalności i równej wariancji między grupami. Genotyp i grupy traktowane następnie porównywano stosując dwuczynnikową ANOVA. W przypadku stwierdzenia istotnych ustaleń, kolejne analizy post hoc przeprowadzono parami za pomocą metody Studenta-Newmana-Keulsa. Wartość AP mniejsza lub równa 0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki Reprezentatywne sekcje wybarwione BrdU pokazano na Figurze 2, a reprezentatywne sekcje wybarwione elastyną pokazano na Figurze 3. Zgodnie z oczekiwaniem, VSMC znakowane BrdU wykryto tylko rzadko w nieuszkodzonych naczyniach zwierząt we wszystkich badanych grupach (średnia <1,0 BrdU komórka / sekcja pozytywna, bez znaczących różnic między jakąkolwiek grupą leczenia lub genotypem). Nieuszkodzone tętnice szyjne od myszy WT i PRKO były nierozróżnialne morfologicznie, niezależnie od przypisania leczenia, a zatem, jak w naszych wcześniejszych badaniach, obszary przyśrodkowe z dwóch grup zostały połączone (średnia = 18,1. 0,3 × 10. 3 mm2). Rycina 2BrdU zabarwionych odcinków nieuszkodzonych i uszkodzonych tętnic szyjnych z tętnicy szyjnej WT i PRKO. Wyróżnione są fragmenty tętnic szyjnych barwionych BrdU reprezentujące średnią liczbę BrdU dla każdej grupy (x 200). Łączna liczba BrdU została dokonana na całej sekcji. We wkładce pokazano przykłady zarówno VDMC z dodatnim wynikiem BrdU (czarne strzałki), jak i VSMC z ujemnym wynikiem BrdU (otwarta żółta strzałka) (x 200). Rycina 3 Uszkodzone i uszkodzone odcinki tętnic szyjnych WT i PRKO myszy wybarwione estrą. Pokazano skrawki tętnicy szyjnej z wybielaniem elastyny reprezentujące średni obszar przyśrodkowy dla każdej grupy (x 200). Pożywka jest ograniczona przez wewnętrzną elastyczną blaszkę (otwarta żółta strzałka) i zewnętrzną elastyczną blaszkę (czarna strzałka). Delecja PR zwiększa odpowiedź z uszkodzeniem naczyń u samic myszy leczonych placebo. Medialna i miejscowa proliferacja VSMC znacznie wzrosła w uszkodzonej tętnicy szyjnej u myszy WT traktowanych placebo (23. 4 komórek wyznakowanych BrdU na odcinek; P <0,001 vs [więcej w: czy da się cofnąć czas, kiedy szczepić na pneumokoki, wyszukiwarka sanatorium nfz ] [hasła pokrewne: olej lniany budwigowy oleofarm, najlepsza pozycja do spania, guz jelita grubego rokowania ]